mRNA稳定性调控其亚细胞定位

神经元是高度极化的细胞,由细胞体(soma, 胞体)和细胞延伸部分(neurites, 突起)两部分组成。这种结构和功能的区分主要是由一些特异的mRNA在细胞中不对称的亚细胞定位造成的。神经元中mRNAs的不同定位使细胞能够通过区域基因调控快速的应对区域信号刺激。这种功能特异性在轴突引导和突触可塑性中起着至关重要的作用,并形成了学习和记忆的基础。

在1990年代早期,研究人员认为mRNAs的3’ UTR区携带一些顺式作用元件(zipcodes)。一些RNA结合蛋白(RBP)结合到mRNAs的zipcodes,并与定位机器发生联系,介导了mRNAs的亚细胞定位【3】。然而,大规模转录组鉴定了成千上万的不同定位的mRNAs,但仅仅发现了很少的zipcodes元件【4-6】。这种特殊序列发现的困难是非常令人不解的,但也预示着,mRNA的亚细胞定位可能还有其它的机制。

研究人员采用了一种微孔膜来培养原代皮层神经元(primary cortical neurons, PCNs),这种微孔膜使神经元的胞体和突起部分分开在微孔膜的两侧,便于分离神经元胞体和神经突起部分,并用于后续实验检测(图1)。利用这种方式,研究人员对神经元内不同亚细胞区域的mRNA半衰期进行了检测,通过SLAM-seq(thiol (SH)-linked alkylation for metabolic sequencing)方法,研究人员发现从细胞核(3.1 h)到细胞质(3.7 h),再到神经突起部分(4.8 h),mRNA的平均半衰期在不断增加,神经突起部分与胞体部分的mRNA平均半衰期相差达到1.1 h。检测mESC来源的神经元得到了类似的结果,说明神经元胞体和突起中定位的mRNA存在明显且一致的差异。

研究人员分析上述实验结果有两个重要推论:一是神经突起定位的转录本普遍具有较长的半衰期;二是更稳定的转录本倾向于定位到神经突起部分。之前的研究已经证实,神经突起中mRNA的半衰期比胞体中的更长。对于第二个推论的验证,研究人员首先分析了所有转录本中稳定性在前10%的基因,发现这些稳定性更强的转录本(平均半衰期5.7 h)大多富集在神经突起部分。以上实验结果表明,上述两个推论都正确,而mRNA的稳定性可以作为mRNA在神经元细胞中不同亚细胞区域定位的一个好的预测指标,稳定性高的mRNA更容易被转运到距离细胞核更远的位置。

为了继续检测稳定性和mRNA定位之间的联系,研究人员通过shRNA敲低Larp1基因的表达降低了RP-5’TOP的稳定性,通过检测发现,RP-5’TOP的转录水平下降,分析其分布区域,发现其在神经突起的下降比胞体部分下降更明显,且RP-5’TOP的转录本定位确实从神经突起转向胞体部分。另外,研究人员还发现,PCNs中Larp1的敲除还降低了突起中β-actin基因mRNA的翻译效率。以上结果表明,LARP1敲除介导的RP-5’TOP转录本稳定性降低会显著影响其亚细胞定位和翻译过程。

为了进一步分析mRNA稳定性和亚细胞定位之间的联系,研究人员通过在神经元中过表达催化位点突变的CAF1(dnCAF1)提高了神经元整体的平均稳定性,检测发现神经突起中mRNA的数量增加了约90%,说明转录本的稳定性提高确实会促进它们向神经突起的定位。由此,研究人员对影响mRNA稳定性的元件对mRNA定位的影响进行了深入的研究。研究人员主要研究了m6A修饰,AREs,优化的密码子以及3’ UTR长度等因素对mRNA定位的影响,因为这些元件或因素都能调控mRNA的稳定性。

mRNA的m6A修饰是一种去稳定性元件,它主要富集在不稳定的mRNA中,本研究显示,m6A修饰低的mRNA稳定性高,主要定位在神经突起,而m6A修饰高的mRNA则主要定位在胞体部分。接下来,研究人员通过shRNA敲低Ythdf或者Mettl3基因表达,或者通过抑制剂STM2457抑制了m6A介导的mRNA降解过程,这些处理导致之前不稳定的mRNA稳定性增强,其定位从胞体转移到神经突起,说明靶向m6A能够调控相关mRNA的亚细胞定位。

与m6A修饰类似,去稳定元件AREs与最优化的密码子同样能够调控mRNA的稳定性,进而调控mRNA的亚细胞定位。研究人员进一步研究了这些元件对mRNA稳定性以及亚细胞定位的调控重要程度,发现m6A对于mRNA稳定性的调控作用最强,其次是3’ UTR长度和AREs元件,最后是优化的密码子。依据这些结论可以实现对相关mRNA定位的精确调控。

总之,本研究发现神经元中mRNA的稳定性与其亚细胞定位密切相关,越稳定的mRNA越可能定位到距离细胞核更远的位置,通过调控mRNA的稳定性能够实现对mRNA亚细胞定位的调控。

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